甜菜孢囊线虫（Heterodera schachtii）是全世界重要的检疫性有害生物，对甜菜具有毁灭性危害。1850 年德国首次报道该线虫(Franklin ＆ Heterodera, 1972) 。到目前为止，该线虫已在全世界的美洲、欧洲、亚洲等50多个国家或地区有分布，20多个国家将该线虫列为检疫对象(Steele, 1984) 。甜菜孢囊线虫是甜菜上危害最严重的病原生物之一，可导致甜菜产量损失25%～50%，每年造成超过150亿美元的经济损失 (Singh et al., 2015)。筛选土壤样本以定性和定量地评估线虫感染是一项预防措施，也是农业害虫管理策略的一个组成部分。
甜菜孢囊线虫以卵的形式在土壤中可以存活多年，孢囊是由雌性线虫的遗骸形成的保护性外壳。雌性线虫死亡后，其体壁变硬，形成棕色的硬化孢囊。量化线虫感染的能力是针对线虫的控制措施以及开发抗线虫植物育种系的先决条件。可以通过孢囊计数来估计线虫种群密度。孢囊需要从含有有机碎片的土壤样品中手工挑选，其中碎片的数量取决于样品提取方法。手动计数是一项耗时的任务，计数准确性受到主观决策、持续专注的能力以及将孢囊与其他颗粒分离的经验的影响。因此，只有自动计数才适用于高通量应用。虽然线虫的数量是一项重要的定量衡量标准，但表型特征（例如孢囊的大小、形状和颜色）也是相关的。研究显示，孢囊大小的增加是马铃薯孢囊线虫种群适应植物抗性的指标（Fournet et al., 2016），这表明孢囊表型与抗性相关。虽然其他数据模式，例如遗传数据，也可以应用于估计线虫感染（Bogale et al., 2020），但只有图像数据可用于表征孢囊的表型。
本文介绍了一种基于计算机视觉的高通量系统，该系统可以量化甜菜孢囊线虫感染并测量孢囊的表型特征。在标准化环境中记录土壤样本提取物的显微图像后，实例分割算法用于检测这些图像中的线虫孢囊。在一项使用已知孢囊数量的真实样本和人工注释图像的评估中，计算机视觉方法产生了准确的线虫孢囊计数以及准确的孢囊分割。基于这样的分割，可以计算出孢囊特征，以揭示不同土壤中线虫种群之间的表型差异，以及甜菜种植前后观察到的种群。计算机视觉方法不仅能够快速准确地计数孢囊，而且能够在不同条件下对孢囊特征进行表型分析，为农业和植物育种研究中的高通量应用提供了基础。源代码和带注释的图像数据集可供科学使用，通过额外的训练数据，该系统也可以推广到其他线虫种类。
土壤样本取自已知具有甜菜孢囊线虫感染历史的土地。通过网筛组合（2 mm和100 μm）制备用于图像采集的土壤提取物。随后，通过离心浮选技术从筛选的土壤提取物中提取孢囊。将孢囊与剩余的有机物部分一起收集在白色滤纸上，以备成像使用。样品图像由德国LemnaTec提供的PhenoAIxpert HM记录（图S1）。它由一个工业RGB相机和高倍物镜系统组成。该系统安装在物体上方 35 cm处，视野为 35 × 25 mm。围绕样品台布置的水平定向LED（4000 K）作为照明光源。所有组件都安装在不透明的机柜内，以保护它们免受外部光线的影响。在PhenoAIxpert HM原型机中，样品台由一个样品架组成，该样品架可以手动移动到预定义的位置，以便执行样品的一系列成像。图像采集由控制计算机手动触发。将来，样品台将被电动X-Y工作台取代，然后自动将样品移动到预定义位置并以同步方式触发图像采集。
图S1 PhenoAIxpert HM将由德国LemnaTec作为商业产品推出（HM：High Magnification）
图1 用于线虫孢囊分割的计算机视觉流程
表1 用于孢囊计数验证的样本
图2 手动孢囊计数与自动孢囊计数的比较
在所有土壤样本类型中，手动孢囊计数与自动孢囊计数相似（图2A），无论孢囊与有机碎片混合（“碎屑”）还是孢囊与有机碎片分离（“干净”）。手动计数和自动计数相关性的皮尔逊相关系数很高，“干净”为0.981，“碎屑”为0.975（图2B），表明使用自动方法可以可靠地估计孢囊的相对数量。
图3 手动孢囊分割与自动孢囊分割的比较
图4 线虫孢囊表型特征的分布（孢囊大小和长宽比）
—— 原文 ——
Chen L, Daub M, Luigs HG, et al. High-throughput phenotyping of nematode cysts. Frontiers in Plant Science, 2022, 13: 965254.
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