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由于全球气候变化，大多数农田栽培的作物都有面临严重胁迫的风险，使农业产量大大降低。通过成像技术对作物进行感知，可以在早期阶段检测到生物或非生物胁迫，从而避免损害和重大减产。叶绿素a荧光成像技术是用于植物胁迫检测的专业技术之一，具有广泛的国际认可度。它可以评估叶片的时空变化，在出现任何肉眼可见症状之前就能对植物生理状态进行症状前监测，从而实现高通量评估。在此，我们将举例说明如何利用叶绿素a荧光成像分析来评估生物和非生物胁迫。叶绿素a能够在甜菜夜蛾摄食后15分钟、西红柿植株感染灰霉病后30分钟检测生物胁迫，或缺水胁迫开始时检测非生物胁迫，因此具有早期胁迫检测的强大潜力。叶绿素荧光(ChlF)分析是一种快速、非侵入性、易操作、低成本和高灵敏度的方法，可估测光合作用性能并检测各种胁迫对植物的影响。在 ChlF 参数方面，开放的光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心的比例(qP)可用于早期胁迫检测，因为最近的许多研究发现它是基于ChlF筛选环境胁迫对植物影响的最准确和最合适的指标。

光合作用的光反应

叶绿素是通过捕光天线吸收光能的主要分子。在光合作用的光反应中，捕光天线吸收的光能会被光化学反应转化成电子进行传递，电子从光系统Ⅱ（PSⅡ）通过细胞色素b6f和质体蓝蛋白（PC）转移到光系统Ⅰ（PSⅠ），最终生成NADPH。除此之外，光系统Ⅱ（PSⅡ）作为一种大型色素-蛋白质复合物，还负责光合生物中水的光依赖性氧化，释放分子氧并向类囊体膜内释放质子（H⁺）。质子最终通过ATP合酶，合成ATP。NADPH和ATP均可用于光合作用的暗反应中CO₂的固定和有机物的合成。

光合作用电子传递示意图

光反应的产物ATP和NADPH必须与碳水化合物和其他必需有机分子的合成相协调。否则，会产生活性氧（ROS）。在光能转化为化学能的过程中，活性氧（ROS）在低水平上不断形成，但它们被不同的抗氧化机制清除。这些 ROS 是单线态激发氧（¹O₂）、过氧化氢（H₂O₂）和超氧阴离子自由基（O₂^-）。过量的光能吸收肯定会使电子传递链容量过度饱和，导致ROS形成的可能性增加。生物和非生物胁迫，如干旱、盐度、金属毒性、冷却、UV-B 辐射、昆虫和病原体都导致ROS（H₂O₂， O₂^-, ¹O₂，OH）在植物体内产生的量增加，这是由于细胞稳态的破坏，可导致氧化应激。氧化应激是由酶促和非酶促抗氧化剂的ROS产生和清除之间的不平衡引起的。这种不平衡会导致细胞损伤，从而导致细胞死亡。因此，植物需要在细胞结构破坏之前对这种不平衡做出反应，以维持光合活性和全株存活。

叶绿体是植物细胞中ROS最重要的创造者，尤其是光合作用的光反应。在大多数环境胁迫条件下，吸收的光能超出其可控制的量，因此会损害叶绿体。保护光合设备免受导致ROS产生的过量光能的过程是非光化学淬灭（NPQ）的机制。植物已经发展了几种光保护机制，包括光通过叶片和叶绿体运动逸出，NPQ机制通过吸收的光能作为热能耗散，PSⅠ周围的循环电子传输，光呼吸途径和ROS清除系统。NPQ的产生可以避免在环境胁迫条件下经常观察到的ROS生成增加。然而，酶促和非酶促抗氧化机制可以消除环境胁迫条件下ROS生成的增加。

叶绿素荧光分析方法分辨率高、快速、无损、成本低，可以通过监测PSⅡ的叶绿素荧光发射来评估光化学的任何变化。该方法可以准确地确定用于光化学的能量(Φ_PSⅡ)，以热量(Φ_NPQ)，或非稳压耗散在 PSⅡ中(Φ_NO)。

叶绿素a荧光分析的基础知识

植物的叶绿素荧光来自吸收的光能中的一小部分重新以光的形式发射，叶绿素荧光可以用来解释植物能量转换相关的为光合作用活性，为光合装置，特别是PSⅡ提供了有价值的见解。叶绿素分子（Chl）吸收光能将其转化为激发态（Chl*），其能量较高，具体取决于用于照明的光波长。激发的叶绿素分子（Chl*）可以以两种激发态存在：单态叶绿素分子（¹Chl*），具有相对短的寿命以及寿命更长的三态叶绿素分子（³Chl*）。单线态激发态叶绿素分子（¹Chl*）可以通过（i）耗散能量为热(NPQ)，（ii）将能量转移到另一个电子受体分子，称为光化学（qP），或（iii）以荧光的形式重新发射为光，叶绿素荧光波长比吸收光更长。在这些途径中，可用于去激发¹Chl*的是光化学反应，它将光能转化为电子传递用于合成化学产物。当光合作用高效进行时，观察到的荧光很少。在以下情况下¹Chl*不是通过上述途径去激发的，它是从高能激发态转换而来的1Chl* 至低能激发态³Chl*通过内部转换或松弛。三态叶绿素分子（³Chl*）能与分子O₂反应产生单氧（¹O₂*），一种非常活泼的活性氧（ROS）。在环境温度下，大多数荧光来自与PSⅡ相关的叶绿素a分子。

叶绿素分子激发与能量去向示意图

测量叶绿素a荧光

叶绿素a荧光可以使用各种方法进行检测，例如脉冲振幅调制(PAM)方法。在开始测量之前，叶片必须经过几分钟或者几十分钟的暗适应，这取决于测量前叶子所处光环境的光强度和植物物种。黑暗中叶绿素a荧光的最小水平Fo通过低强度测量光ML获得，而暗适应叶片的最大荧光产量Fm则用饱和光脉冲SP进行评估。在光化光照明AL（即施加的光强度）下，可以使用另一个饱和脉冲估计光适应状态下的最大荧光Fm′。在施加的光化光AL关闭之前测量荧光的稳态水平Fs。除此之外，在关闭AL后，开可以测到另一个叶绿素荧光的最低水平Fo′。Fm′和Fo′之间的差异是光下的最大可变荧光Fv′。根据这些测量的基本叶绿素荧光参数，可以计算出其他一些更常用于叶绿素荧光分析的参数。

脉冲振幅调制叶绿素荧光测量过程示意图

叶绿素荧光成像用于非生物应激检测

水分充足（对照）的拟南芥（a）和缺水胁迫开始时（对照植株土壤容积含水量的 95-96%, SWC）的拟南芥（b）叶片上开放的 PSⅡ 反应中心（qP）的差异。右侧的颜色代码表示qP值，范围从0到1。

在0 µM（对照）、40 µM或 120 µM Cd²⁺ 胁迫条件下生长3天和4天的Noccaea caerulescens植株。图中显示了开放的PSⅡ反应中心的比例（qP）。右侧的颜色代码显示 qP值的范围为0.0至1.0。

Noccaea caerulescens中开放的PSⅡ反应中心部分（qP）对镉暴露的U型双相响应曲线。在 40 µM 的镉浓度下暴露3天后，观察到开放的 PSⅡ 反应中心(qP)的比例下降，而暴露时间更长(4 d)后，由于诱导了应激防御反应，qP增加。同样的120 µM Cd暴露时间（3天）导致qP增加。这种激素反应被认为是由ROS水平的增加引发的，而ROS 被认为有利于引发防御反应。

生物胁迫下番茄叶片的叶绿素荧光成像结果。其中每个像素的颜色代表 Spodoptera exigua 幼虫取食前（a）和取食15分钟后（b）番茄小叶中Fm（暗适应最大叶绿素a荧光）。(a)中用圆圈表示取食前的十个感兴趣区域（AOIs），(b)中为相同的感兴趣区域、两个取食点（星号表示）和另外五个感兴趣区域（箭头表示）。白色箭头所指的取食点覆盖了整个 AOI。黑色箭头指向现有AOI附近的周围区域。AOI 的圆圈上有红色标签，标注了其所在位置的Fm值。右侧的颜色代码显示Fm值的范围为0.0至0.4。

茄科植物小叶在被Spodoptera exigua幼虫取食前（0分钟）和取食 15、90和180分钟后的Φ_PSⅡ、Φ_NPQ和Φ_NO的彩色图片。取食前的AOIs用圆圈表示，而相同的AOIs、三个取食点的AOIs（用星号和箭头表示）以及取食区周围的AOIs区则用圆圈表示。AOI的圆圈上还用红色标签标注了相应的参数值。右侧的颜色代码显示了参数值的范围为0.0至0.5。

在植物表型分析中利用现有成像工具具有巨大潜力，可以加快我们对植物功能的认识。这些工具可以建立基因功能与环境反应之间在代谢、生化和信号转导过程等多个途径上的联系。在这些工具中，叶绿素荧光成像(ChlF Imaging)分析是一种快速、非侵入性、高成本效益和高灵敏度的方法。这种方法能精确估计光合作用的性能，并能检测植物受到的各种胁迫影响。叶绿素荧光成像作为一种在肉眼可见的症状出现之前检测生物和非生物胁迫的技术，其潜力已在园艺领域得到证实，并已有效地应用于采收前和采收后的各种情况。叶绿素荧光成像作为一种技术，对于研究生物和非生物胁迫因素下叶片光合作用的异质性特别有价值，而且还能筛选大量样本，提供早期胁迫检测诊断。然而，该领域的进一步研究仍然至关重要，其最终目的是加快农业生产。叶绿素荧光分析方法可用于构建各种作物品种的综合胁迫耐受性数据库，以便根据环境条件优化光合功能，应对气候变化，从而提高作物产量。

在各种叶绿素荧光成像的参数中，开放的PSⅡ反应中心的比例（qP）被认为是最适合用于早期胁迫检测的指标。最近的研究一致发现qP具有很高的灵敏度，非常适合用于探测光合作用的功能，可在早期评估非生物和生物胁迫对植物的影响。我们建议科学家在进一步的研究中考虑将QA 氧化还原状态的叶绿素荧光参数纳入其工作中。

本研究中叶绿素荧光成像的图片由IMAGING-PAM获得。

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