双单倍体（Doubled Haploid）育种，简称DH育种，是利用诱导系诱导（或花药离体培养等手段诱导）产生单倍体植株，再通过染色体组加倍（自然加倍或药剂处理）使植物恢复正常染色体数的育种方法。DH育种能够在较短时间（2代）内便可以选育出DH纯系，大大缩短育种年限，是加速种质材料纯化、缩短育种年限的有效途径，是现代生物技术育种的主要支柱技术之一。
由于自然单性生殖或孤雄生殖单倍体非常罕见，因此单倍体的获得成为单倍体育种的一个难点，游离小孢子培养是获得单倍体的重要手段之一。植物游离小孢子培养受外植体预处理、小孢子预处理、供体基因型、小孢子培养密度、培养基pH值和培养基成分等因素的共同影响，因此无法形成通用的诱导策略，需要从花芽选取、小孢子胚诱导、二倍体化等各个环节进行不断的调整和改善，才能构建一种植物优选的游离小孢子培养体系。
本文利用Ampha Z32花粉活力分析仪（阻抗流式细胞技术，IFC）进行了系列测试，以期帮助广大科研用户构建优选的游离小孢子培养体系，提高游离小孢子的培养效率：1）确定小孢子各发育阶段的相位角-振幅散点图，并归纳发育变化轨迹；2）确定培养开始前和整个培养过程中小孢子的活力；3）估算小孢子的密度；4）监测小孢子对诱导策略和培养条件的响应，进行产胚率的早期预测。
—— 小孢子发育阶段 ——
小孢子发育时期是影响小孢子培养的关键因素之一，选择合适的花粉发育时期可极大的提高植株小孢子胚状体发生的诱导效率。大量研究表明，通常小孢子培养的最佳时期是单核晚期（单核靠边期）和双核早期，这可能是由于单核靠边期的小孢子处于面临不同分裂方式和发育途径的敏感时期，更容易诱导成功。因此，准确判断并选择最适时期的小孢子进行培养，是提高产胚量的基本保障。
传统上进行小孢子发育阶段的鉴定是通过染色镜检法，即用DAPI或乙酰胭脂红对采自不同大小花蕾或穗的小孢子进行染色，然后显微镜观察细胞核的数目和形态，并计数以确定各发育阶段细胞所占的比例，此过程极其费时、耗力。
由于处于不同发育阶段的小孢子的体积、细胞质和细胞膜的特性不同，Ampha Z32花粉活力分析仪所检测到的电阻抗信号也就不同，由此而生成的相位角（X-相对活性）-振幅（Y-相对大小）散点图不同，所形成的散点类群也不同。如图1所示，小麦孢子发育过程散点图的变化以及DAPI染色法确定的对应发育阶段。本测试使用AF6缓冲液从单个小穗的花药中分离出小孢子，取极小的一部分进行DAPI染色，剩余部分经过滤稀释后用Ampha Z32花粉活力分析仪进行测量。
图1 小麦孢子发育变化轨迹
我们测试了多种植物在不同发育阶段的散点云图，并对比了不同发育阶段散点云变化，结果表明通过散点图的变化轨迹均可以准确区分出小孢子的不同发育阶段。如图2所示，不同发育阶段的散点颜色不同，三细胞花粉物种（西蓝花、辣椒）成熟轨迹中的散点类群明显多于二细胞花粉物种（水稻）。利用Ampha Soft软件的统计分析功能，我们可以量化每个颜色类群的散点数，即统计出每个发育阶段的小孢子的数量及比例，帮助确定特定发育阶段占比较高的花芽的大小或小穗所处的位置，如图3所示。小孢子发育阶段的准确判定，为小孢子供体的选择带来极大的便利，可极大的提高植株小孢子胚状体发生的诱导频率。
图2 小孢子不同发育阶段的散点云叠加图
图3 麦穗不同穗位的单核、双核和三核小孢子的比例
尽管同一物种的花粉在发育的单核早期、单核晚期及成熟早期的相位角-振幅散点图中具有相似的相位角，但振幅大小却可能差异显著，这是由于遗传变异会影响小孢子的大小，因此我们建议根据基因型评估不同花粉的发育阶段。
—— 小孢子的活力和密度 ——
小孢子的活力和密度亦是影响小孢子胚状体产生的主要因素。本实验利用Ampha Z32花粉活力分析仪对这两个指标进行了测试，同时利用FDA染色法测试细胞活力，利用血球计数器进行细胞计数。
Ampha Z32花粉活力分析仪（Amphasys，瑞士），通过检测流经交流电场的花粉悬浮液中花粉的电阻抗信号，分析获得花粉的数量、大小、活性，测量过程中确保悬浮液介质电导率的稳定对准确评估花粉活性是非常重要的。大量实验表明，缓冲液（AmphaFluid）体积占比达到50-80%，才能较好的评估小孢子的活性，由于不同培养介质的电导率不同，建议通过多次实验确定小孢子培养液和缓冲液（AmphaFluid）的较优体积比。移取精确体积的小孢子混合液后，在Ampha Z32花粉活力分析仪的计数模式下进行测量即可确定小孢子的准确浓度，并统计出活性小孢子的数量，整个测试过程不超过2min。
图4 南瓜小孢子散点图
—— 诱导成功率评估及产胚量的早期预测 ——
法国Vegenov研究所利用AmphaZ32花粉活力分析仪追踪了小麦小孢子的发育过程（案例介绍：Ampha Z32在小麦孢子发育及产胚量早期预测中的应用）。实验结果显示，经诱导处理后，大部分小麦小孢子在培养的几天内就停止了发育，只有一小部分活细胞能逐渐分裂成星形小孢子，最后形成有组织结构的胚状体。
Vegenov的研究发现，IFC信号随小麦小孢子形态、细胞大小的变化而变化，结合显微镜镜检（图5），可以准确匹配到小孢子发育的不同阶段。从IFC信号所确定的相位角-振幅散点图中可利用多边形门控区分出处于不同发育状态的小孢子类群，如图6所示。其中小孢子经过胁迫处理后（D0），相位角-振幅散点图中出现的P2细胞类群为具有活性的小孢子群，后续实验证明，这一类群反映了小麦小孢子对诱导处理的响应，可帮助在小孢子培养前确定诱导处理的效果，提高胚状体发生的成功率。而培养开始后出现的P3细胞类群，与花粉发育（配子体发育途径）过程中发现的任何细胞类群都不重叠，这表明该类群是孢子体发育途径中特有的细胞类群。培养过程中，该类群细胞数量逐渐减少，振幅和相位逐渐增大，说明部分小孢子在这一过程中死亡，而部分小孢子胚在不断生长发育。此外，本实验还以IFC测试数据为基础，建立了预测胚胎产量的线性数学模型，统计分析表明，培养第7天P3类群的细胞数量可以准确预测30d后的胚胎产量（y=6.539x-20.827；R^2=0.9519，p <0.05）。
图5 Pavon小麦配子体和孢子体途径的发育阶段
（A）单核小孢子；（B）双核小孢子；（C）花粉粒；（D）星形小孢子（v为液泡）；（E）多核小孢子；（F）质膜化小孢子
图6 Pavon小麦配子体和孢子体途径的发育阶段（IFC法）
配子体途径：ML：单核中晚期；EB：早期双核；LB：单核晚期；ET：三核早期；LT：三核晚期。孢子体途径：培养前21天、培养第0、1、5和7天的小孢子发育状态。ML/D-21代表配子体发育和孢子体发育的共同阶段，红色垂直门控右侧为活性细胞，蓝色多边形门控P1为雄核发育开始时的活性孢子群；绿色多边形门控P2为胁迫处理后，孢子离体培养前（D0）的活性孢子群；紫色多边形门控P3为离体培养1天后的活性孢子群。
以上结果表明，IFC法可以在DH育种过程中，帮助选择小孢子植物供体，评估小孢子胚诱导策略，优化培养条件，并在小孢子培养早期进行产胚量的准确预测，可显著提高游离小孢子培养的成功率，进而加快DH育种的效率。
案例介绍视频：Accelerating Doubled Haploid Plant Production with Impedance Flow Cytometry，Password: #9w6Z6y&
原文阅读：Accelerating Doubled Haploid Plant Production
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