Ampha Z32花粉活力分析仪的应用：评估大麻花粉的活性和数量
日期：2022-04-20 18:13:36
大麻（ Cannabis sativa L.），大麻科大麻属，一年生草本植物，广泛种植于亚洲、欧洲及南美等国家和地区，是我国传统的纤维作物，具有重要的经济利用价值，被广泛应用于纺织、食品、造纸和建筑等多个领域。因大麻中的四氢大麻酚（THC）具有致幻成瘾的特性，故根据其含量不同而被区分为工业大麻（中国THC＜0.3%，欧盟＜0.2%，美国＜0.5%）和毒品大麻。大麻素是大麻中特有的含有烷基和单萜基团分子结构的一类次生代谢产物，最主要2种成分是四氢大麻酚( THC) 和大麻二酚( CBD) 。大麻二酚( CBD) 是非精神活性化合物，可以拮抗 THC 与受体的结合，消除 THC 对人体产生的致幻作用，除此之外 CBD 具有抗炎、杀菌、镇痛、抗焦虑、抗氧化等作用，同时还具有治疗精神分裂和阿尔兹海默症等病症的潜在医疗价值，随着对其药理作用的挖掘，选育高CBD含量低THC水平的药用大麻品种以已成为全球性的热点研究。但由于工业大麻为多为雌雄异株植物，主要是由雌株合成植物大麻素、萜烯和其他次生代谢物，雄株产生花粉，通常大麻素浓度很低，因此药用大麻的全雌系选育或诱雄制种对于雌株性状的保存具有极大的意义，也是目前面临的一项巨大挑战。全雌系诱雄过程中，鉴定花粉的活力和数量（代表雄配子体的适应性）对于成功授粉至关重要。德国霍恩海姆大学的研究者在本次研究中利用Ampha Z32花粉活力分析仪（阻抗流式细胞仪，IFC）：● 评估了两种富含植物大麻素的大麻基因型KANADA（KAN）和A4的花粉活力（PV）和花粉数量（TPC）；● 研究了硫代硫酸银溶液（STS）和赤霉素溶液（GA3）诱导对两种大麻基因型PV和TPC的影响；● 研究开花天数（DAF）对基因型内和基因型间PV和TPC的影响。结果表明，IFC法可准确测量大麻的花粉活力并有效估算花粉数量，是一种高效、可靠、无标记的测量方法，可进一步协助药用大麻的育种策略，为大麻植物育种和种植生产开辟新的机会。
Ampha Z32花粉活力分析仪（瑞士Amphasys AG）信号的采集和转导A）细胞在不同频率的交流电场中的检测结果，低频下反映细胞的体积特性，高频下反映细胞膜的介电特性即细胞活性；B) 微流控芯片；C）流经交流电场的细胞的阻抗信号（蓝色实部即电阻信号，绿色虚部即容性电抗信号），细胞膜完整性决定容性电抗的大小，故可通过虚部信号来区分活细胞和死细胞，最终以阻抗相位角-振幅散点图反映出来Ampha Z32花粉活力分析仪细胞仪（瑞士Amphasys AG），通过检测流经交流电场的细胞悬浮液中细胞的电阻抗信号，分析获得细胞的数量、大小、活性。该仪器可以在0.3-30MHz的范围内同时测量4个不同频率下细胞的电阻抗特性，适配微流控芯片通道尺寸范围为15-400μm，可满足0-300μm范围内的任意生物、非生物单细胞的活性测量。已有研究报道，硫代硫酸银溶液（STS）和赤霉素溶液（GA3）可通过与乙烯激素竞争诱导全雌系植株雄花形成并开花，本实验研究了KAN和A4两种基因型大麻经这两种诱雄激素诱导开花后的第11、14、18、21和24天（DAF）所收获的雄花数。实验结果显示，所有经GA3和STS溶液处理的植株都产生了雄花，且植株雄花数量均随时间推移而增加，这表明诱雄激素和开花天数的交互作用对雄花数量有显著影响（表1）。相较于DAF前期，DAF后期雄花数量的增加更为显著，其中GA3处理的植株在24DAF的单株雄花数最高，为220.60；STS处理的植株在24DAF的单株雄花数最高为273.33（图1a）。
图1 在开花第11、14、18、21天（DAF）收获的雄花数a）赤霉素（GA3）和硫代硫酸银溶液（STS）处理；b）两种基因型KAN和A4。此外，基因型和DAF的交互作用同样显著影响植株雄花数量（表1），即基因型KAN和基因型A4的雄花数量均随采样时间的推移而增加，其中基因型KAN在24DAF产生的雄数量最高，为189.74；基因型A4在11、21、24DAF的雄花数量显著高于基因型KAN，且在24DAF的雄花数量最多，达到317.78（图1b）。表1 每株雄花数、花粉细胞总数（TPC）和花粉活力（PV）的性状方差分析表
不同诱雄激素下，不同开花天数的花粉细胞总数（TPC）如图2所示，GA3诱导下植株的平均TPC仅为850-1500，而STS诱导下植株的平均TPC在8-14DAF呈上升趋势，并在14DAF达到最高（1.54×105），随后逐渐下降，在24DAF时最低（6.67×104），总体而言，STS所诱导植株产生的TPC大约是GA3诱导下的100倍，可见两种诱雄激素下的平均TPC存在显著差异，但两个基因型间的平均TPC并未发现显著差异（表1）。
图2 赤霉素（GA3）和硫代硫酸银（STS）诱导开花后的不同天数产生的平均花粉细胞总数（TPC）花粉数量可能是提高杂交种子产量的关键性状之一，但在以往确定雌株大麻诱雄效率的研究中，却并未考虑花粉数量。在本次研究的采样期间内，两种诱雄激素处理下的两种基因型的雄花数量差异均不显著，但TPC差异显著，STS处理产生的花粉细胞数量明显高于GA3。因此在大麻育种过程中，通过STS可诱导雄花并产生足够数量的花粉供授粉，可有效减少雄株的种植比例，且从花粉数量推断14-18DAF可能是理想的采粉窗口期。如表1所示，基因型、诱雄激素类型以及开花天数（DAF）的交互作用显著影响花粉活性（PV）。相较于STS处理，两种基因型在GA3处理下的PV在所有DAF内都较低，但差异大小各不相同。STS处理下，基因型A4在18DAF的PV最大（79.36%），但与14 (77.88%)、21 (71.33%) 和 24 (51.92%) DAF的PV无显著差异，8(45.66%)和11(53.86%)DFA的PV较低（图3a）；而基因型KAN在11DAF的PV最大（78.18%），与8 (71.23%)、14 (77.22%)、18 (67.20%) 和 21 (70.43%) DAF的PV没有显著差异，但24 (36.49%)DAF的PV明显下降。GA3处理下，基因型A4的PV在11（34.90%）DAF最高，24 (14.88%) DAF最低；而基因型KAN的PV在14（24.24%）DAF最高，8DAF最低，仅为0.63%（图3b）。
图3 基因型（a）A4和（b）KAN在GA3和STS处理下的花粉活性力（%）花粉活力对温度和湿度极其敏感，IFC法可在收获花粉后立即测量花粉活力，避免长时间暴露于环境压力所导致的花粉活力受损，可有效指导花粉收获的最佳时间。本次研究结果表明，8-24DAF为大麻花粉收获的窗口期，利用这17天的窗口期灵活调整雌花开花的同步性，可有效提高大麻育种中的授粉成功率。
