全球气候变暖导致的高温严重威胁农作物产量，而光合作用是作物产量形成的重要因素，同时也是对高温最敏感的生理过程之一，高温胁迫会破坏叶绿体功能，包括叶绿素合成、光化学反应效率和电子传递链活性。因此产生抑制光合作用效率阻碍植物生长并降低作物产量的负面作用，然而其分子机制尚未完全阐明。
高等植物线粒体和叶绿体作为半自主细胞器含有部分遗传物质，可以转录编码自身所需蛋白质的RNA，且该RNA存在大量的编辑位点。植物叶绿体和线粒体的RNA编辑(C-U)是校正转录本错误的重要过程,异常的RNA编辑可导致植物发育缺陷和非生物胁迫响应失调。编辑过程依赖于编辑体(editosome)，其核心组分包括：1.PPR蛋白，通过序列特异性识别靶RNA位点。2.MORF家族蛋白（如MORF8），与PPR蛋白互作，增强其RNA结合能力。脱氨酶：催化C(胞嘧啶)到U(尿嘧啶)的化学修饰。MORF8是唯一一种在叶绿体和线粒体中双重定位的蛋白家族成员，其功能缺失会导致胚胎致死，表明其在RNA编辑中的核心地位。RNA编辑对叶绿体中光合作用相关基因的调控至关重要，而热胁迫则显著抑制这一过程。那么热胁迫是如何调控RNA编辑过程的？热胁迫对光合作用的影响是否能够通过对RNA编辑过程的调控来实现？
2025年3月21日，Nature Communications在线发表了清华大学生命科学学院方晓峰课题组题为“Solid-like condensation of MORF8 inhibits RNA editing under heat stress in Arabidopsis”的研究论文。该研究发现，叶绿体定位的MORF8蛋白能够在热胁迫下形成固态凝聚体，并招募特定的RNA编辑因子PPR蛋白进入凝聚体中以减弱PPR蛋白与其靶向RNA的结合能力，从而降低叶绿体中对应RNA位点的编辑效率，最终导致光合膜蛋白复合体(如NDH-PSI)活性受损，光合作用效率下降(下图)。
MORF8蛋白相分离工作模型。正常温度条件下，MORF8促进PPR蛋白与RNA结合；热胁迫诱导条件下，固态凝聚体形成，隔离编辑体组分，抑制NDH复合体功能。
该研究发现，RNA编辑因子MORF8能够特异性地响应热胁迫发生相分离。42°C处理10分钟后，叶绿体内MORF8凝聚体数量增加5倍(图1a)。FRAP显示荧光恢复率仅8%(图1d)，且1,6-己二醇处理不溶解凝聚体(图1e)。此外，体外数据表明，IDR(蛋白质固有无序区域)是相分离的关键，ΔIDR突变体完全丧失凝聚能力(图2e)。DLS(动态光散射)显示IDR单独响应温度变化，37°C时粒径从10 nm增至250 nm(图2j)。上述结果表明MORF8通过IDR直接感知温度，形成固态凝聚体，可能通过降低蛋白流动性实现持久胁迫响应。在烟草和拟南芥中的一系列实验也都证实了MORF8的凝聚体是固态的，并且能够通过离心分离获得凝聚体组分。
图1 MORF8蛋白响应热胁迫形成固态凝聚体。
图2 MORF8蛋白的体外相分离特性
MORF8凝聚抑制RNA编辑效率方面的研究数据表明，amiR-MORF8植株中，23/34个叶绿体编辑位点效率下降>50%(图3a)；过表达MORF8导致16个位点(如ndhD-2)效率降低30%-90%(图3b)。生化机制相关的EMSA分析显示，MORF8凝聚体将PPR蛋白DGI与ndhD RNA的结合减少70%(图5c-e),表明进入凝聚体的PPR蛋白与靶标RNA的结合能力显著降低，这意味着MORF8的聚集是不利于有活性的编辑体组装的。质谱鉴定到CRR21等PPR蛋白被招募至凝聚体(图4e-g)。上述研究结果表明固态凝聚体通过隔离编辑体组分抑制RNA结合，且不同刺激(过表达vs.热胁迫)可能动态改变凝聚体组成。
该研究进一步评估了NDH复合体功能受损对光合作用的影响。蛋白表达水平方面，免疫印迹显示，热胁迫8小时后NdhH蛋白减少60%(图6d)。BN-PAGE显示NDH-PSI超复合体减少50%(图6f)，叶绿素荧光分析表明NDH活性下降65%(图6e)。ndhD-2编辑缺陷导致NDH复合体组装失败，破坏PSI循环电子传递，加剧光抑制和ROS积累。总之研究者通过对一系列体内实验和光合作用相关参数的比较分析，建立了MORF8蛋白的相变与光合作用调控机制的耦合关系(图6)。
图6 MORF8凝聚损害NDH活性与光合作用
综上所述，本研究首次揭示MORF8蛋白通过固态相分离调控叶绿体RNA编辑的热响应机制，阐明了高温抑制光合作用的分子通路。量化数据表明，热胁迫通过降低关键编辑位点效率(如ndhD-2编辑效率下降60%)，导致NDH活性丧失和光合损伤。这一发现为作物抗逆性改良提供了新靶点，并拓展了相分离在植物逆境生物学中的研究维度。
Wu, J., Wang, Y., Chen, H. et al. Solid-like condensation of MORF8 inhibits RNA editing under heat stress in Arabidopsis. Nature Communications 16, 2789 (2025).
如图6.e所示，使用PAM叶绿素荧光仪(如PAM-2500，DUAL-PAM-100等)测量光化光关闭后叶绿素荧光瞬时上升的动力学轨迹(Post-illumination transient increase in chlorophyll fluorescence)可以用来表征NDH介导的环式电子传递活性，因此该方法也称为NDH活性测量。该方法测量的流程非常简单，使用暗适应的叶片先在测量光下记录最小荧光Fo，之后用光化光诱导样品达到稳态，最后关闭光化光记录荧光信号的上升。根据作用光关闭后荧光信号上升曲线的斜率来评定循环电子传递的快慢，斜率越大，循环电子传递速率越快，反之越慢。
图片来自《光合作用研究技术》
使用PAM荧光仪测量NDH活性的操作要点如下：
1、表征NDH活性的测量对象为PSII荧光(Fluo)。
2、建议使用毫秒(1ms)级时间分辨率采集荧光动力学曲线。
3、测量光低频(MF-L)不宜太低，建议设置为500-1000Hz。
4、为了使样品初始状态没有光抑制或记忆效应的影响，建议暗适应后或在低光强下开始并避光测量。暗适应样品可以测FoFm，低光强下开始就无需测FoFm了。
5、PAM荧光仪支持手动进行一次完整测量动作后保存测量流程，重复测量。
使用PAM荧光仪测量NDH活性的操作流程如下：
1、慢速动力学曲线窗口将运行模式改为Manual。
2、将样品加在暗适应叶夹，如果是开放叶夹(如2035-B叶夹或DUAL-PAM-100的探头)需遮蔽环境光。
3、打开测量光，观察Ft(或Fluo)信号值，建议使Ft(或Fluo)在0.2-0.6之间，比如0.3或0.4。确认Ft(或Fluo)满足测量要求后，关闭测量光。
4、选择一个中低强度的光化光作为诱导实验的光强，实验室/温室等室内培养的植物，建议50-100 μE，室外植物可以考虑使用略高的光强，如100-200 μE。
5、在Manual模式下开始(Start)慢速动力学曲线(Slow Kinetics)。
6、等待3-5秒，读取基线，此时荧光信号应该为0。
7、打开测量光，荧光信号上升至预设值(比如0.3或0.4)。
8、等待3-5秒，读取只有测量光时的基线，此时荧光信号应该为一条接近水平的线。
9、如果需要，可以点击[FoFm]，测量Fv/Fm，如果不需要，可省略此步骤。
10、打开光化光，直至荧光曲线走平稳定。
11、关闭光化光，直至曲线鼓起后再下降至走平稳定。
12、点击Stop，结束慢速动力学曲线(Slow Kinetics)13，手动关闭测量光
13、如果您用的是PAM-2500，测量完成后，在慢速动力学曲线窗口将运行模式改为Trig. Run，会弹出一个对话框，用来保存刚才的操作流程。您可以看到动作的时间节点是毫秒(ms)。根据个人需要，可以将时间节点改为整数后保存。后续实验只需更换样品后，在Trig. Run模式下点Start即可。
14、如果您使用的是DUAL-PAM-100，测量完成后需要点击曲线右边的“Copy Trig. Run from Man. Rec”按钮，将刚才手动执行的所有操作Copy到Settings→ Trig. Run窗口并生成Trigger文件。点击保存，存储Trigger文件用于后续实验使用即可。后续实验只需更换样品，将慢速动力学曲线(Slow Kinetics)运行模式改为Trig. Run，点击Start即可。
15、将Manual和Trig. Run测量的慢速动力学曲线导出，截取光化光关闭前-后时间区间内的动力学轨迹作图，分析即可。
注1：PAM软件里，μE=µmol m⁻² s⁻¹
注2：早期的培训资料里，NDH活性的测量还可以通过Script完成，后来由于Script的执行时间节点为秒(s)，导出数据作图时时间节点无法完全统一，使用越来越少了。
电话：021-32555118，邮箱：sales@zealquest.com