这是通讯作者单位完全来自国内的首篇四通道动态LED阵列近红外光谱仪DUAL-KLAS-NIR应用文献。
光合作用是植物和藻类将光能转化为化学能的核心过程，但其效率受限于动态光环境的影响。在高光强下，光系统II(PSII)到光系统I(PSI)的电子传递链(ETC)易产生电子堆积，导致活性氧(ROS)生成，进而损伤光合机构(如PSII核心蛋白D1、RuBisCO等)。为应对高光胁迫，植物和藻类进化出了短期保护机制(如非光化学淬灭NPQ)和长期适应策略(如调整光系统复合体的比例)。然而，质体蓝素(Plastocyanin, PC)作为类囊体腔内的可溶性电子载体，其在高光适应中的作用尚不明确。
质体蓝素PC位于细胞色素b6f复合体(Cytb6f)与PSI之间，参与线性电子流(LEF)和环式电子流(CEF)。此前研究表明，PC水平与光合电子传递(PET)效率相关，但其调控机制仍不清楚。例如，拟南芥中PC过量表达可增强植物生长和抗逆性，但其对光合碳固定和高光耐受的具体作用仍需深入探究。
2025年3月21日，Communications Biology在线发表深圳大学李晓政&胡章立教授团队，中科院植物所杨文强研究员课题组合作完成的，标题为“Plastocyanin affects photosynthesis and high light acclimation by modulating redox states of electron transport chain in Chlamydomonas reinhardtii”的研究论文。本研究以模式绿藻莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)为实验对象，通过构建PC过表达(OEPC)和敲低(pckd)株系，系统解析质体蓝素PC通过调节电子传递链(ETC)氧化还原状态影响光合效率和高光适应的分子机制。
实验材料：莱茵衣藻野生型株系为CC849(自有)和CC5352(美国明尼苏达大学衣藻资源中心)，过表达株系OEPC以及敲低株系pckd。
光合活性测量：使用双通道叶绿素荧光仪DUAL-PAM-100测量样品(2 mL,30 μg Chl)的PSII实际量子产率(Y(II))、电子传递速率(ETR(II))及非光化学淬灭(NPQ)。通过QA还原水平间接评估PQ库还原状态。通过DUAL-PAM-100近红外差示吸收分析P700氧化状态(Pm, Pm', P700ox, Y(I), Y(ND), Y(NA))及环式电子传递(CEF)活性。通过JTS-10光谱仪分析P700、Cytf和PC氧化还原状态；通过四通道动态LED阵列近红外光谱仪DUAL-KLAS-NIR测量PC、Fd和P700的氧化还原吸收光谱。通过氧电极法测量暗适应(5min)细胞在200 µmol m⁻² s⁻¹光强下照射5分钟的氧气释放速率。
除此之外，本研究还进行了藻株生长速率曲线和总叶绿素相关的生长测量，超氧阴离子(O2⁻)生成相关的ROS检测，免疫印迹分析，透射电镜(TEM)观察类囊体膜结构及淀粉颗粒含量，RuBisCO和ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)活性测量。过表达OEPC株系与野生型株系转录组测序，比较的基因表达差异。
研究人员首先对PC过表达株系的生长特征进行了研究。生长优势分析显示过表达株系OEPC在固体和液体培养基中均表现出更快的生长速率(图1C、D)，且在400 µmol m⁻² s⁻¹高光下无明显生长抑制，而野生型株系(CC849)则生长显著延迟(图6A)。
图1 不同PC水平的C. reinhardtii表型。
光合效率提升方面，过表达OEPC株系的放氧速率较野生型提高33%(图1E)。叶绿素荧光数据显示OEPC过表达株系的PSII实际光化学量子产率Y(II)和相对电子传递速率ETR(II)都高于野生型CC849(图2A、C)，而pckd中则低于CC5325(图 2B，D)。光曲线测量NPQ的结果显示，OEPC株系的Y(NPQ)明显高于野生型CC849，而在pckd中仅略高于CC5325(图 2E，F)。诱导曲线+暗弛豫的测量结果显示OEPC的NPQ在光照的前100秒内达到0.8的较高水平，然后相对稳定地保持在0.7和0.8之间。CC849的NPQ最初上升到0.6的较低水平，然后下降到0.4，随后上升到1.0的最高水平(图2G)。而CC5325 的NPQ在100秒时先达到0.6，然后下降到0.3，随后恢复到0.7并保持相对稳定(图2H)。P700近红外差示吸收测量PSI氧化还原和电子传递的结果显示，OEPC的ETR(I)比CC849高48%，而pckd比CC5325低17%(图2J)。根据受体侧限制Y(NA)的评估，OEPC中较大的ETR(I)并没有对PSI受体产生很大的还原压力。相反，在OEPC中观察到的Y(NA)低于CC849，而在pckd中检测到的Y(NA)高于CC5325(图2I)。此外，OEPC的供体侧限制Y(ND)比CC849大，而pckd和CC5325的Y(ND) 没有明显差异。因此，Y(I)在OEPC中增加，而在pckd中减少。
图2 PSII和PSI的光合参数。
免疫印迹分析表明，与野生型相比，OEPC中LHCSR3蛋白含量明显降低，而pckd中则有所增加(图S4)。此外，与野生型相比，LHCSR3.1和LHCSR3.2的基因表达水平在OEPC 中降低，而在pckd中上调(图S3)。
补充图S3 过表达和野生型株系中捕光天线复合体蛋白基因的表达水平。补充图S4 CC849、OEPCs、CC5325和pckd株系中LHCSR3蛋白水平的变化。
进一步研究PC调控ETC氧化还原状态的相关结果表明，PQ库还原水平降低，OEPC中QA的还原程度低于野生型(图3A)，表明PC过表达减少了PQ池的过度还原。DUAL-KLAS-NIR分析显示PC氧化水平升高，OEPC中PC的氧化比例(PC⁺)显著增加(表2)，尤其在800 µmol m⁻² s⁻¹下，PC氧化比例达69%(野生型为56%)。此外，过表达株系OEPC中Fd的还原程度降低(图3G、I、K)，可能与碳同化增强有关。
图3 ETC组分的氧化还原状态及ROS产生。
补充图S6 P700、Fd和PC差分模型图(DMP)原始数据。(A)P700差分模型图是通过每20s施加一次的多周转闪光脉冲(光强13000 µmol m⁻² s⁻¹，持续时间50ms)测量，并对25次测量进行平均后得到的； (B) Fd差分模型图是通过600 ms光照(1350 µmol m⁻² s⁻¹)和30s的黑暗间隔测量，并对20次测量进行平均后得到的；(C) PC差分模型图使用KLAS软件自带的默认协议进行测量。
类囊体结构紧密性分析的TEM观察结果显示过表达株系OEPC的类囊体膜堆叠比 野生型CC849 更紧密，而pckd表现出比CC5325更松散的膜结构。淀粉颗粒含量方面，OEPC细胞的淀粉含量显著低于CC849，而pckd细胞的淀粉水平高于CC5325(图4B)。
图4 透射电镜(TEM)下的细胞结构。
ROS生成与碳代谢方面的研究结果显示，ROS水平降低，NBT染色显示，OEPC在高光下产生的超氧阴离子显著少于野生型(图3M)。碳固定增强：RuBisCO活性在OEPC中显著升高(图5B)，且CBB循环相关基因(如RBCS、GAP3)表达上调。淀粉合成抑制：AGPase活性下降(图5C)，细胞淀粉含量减少，可能与Fd还原水平降低导致的Fd-TRX系统活性下降有关。
图5 卡尔文循环和淀粉合成相关基因与酶活。
进一步的研究评估了高光适应中的PC动态积累。PC诱导表达结果显示，野生型CC849在高光(400 µmol m⁻² s⁻¹)下培养4天后，PC含量显著积累(图6E)，同时QA还原水平逐渐下降(图6F)。光系统II修复增强：OEPC的PSII最大量子效率(Fv/Fm)在高光下保持稳定，而野生型需数天恢复(图6I)。
图6 高光耐受性与PC积累的动态关系。
基于上述研究总结出PC调控光合作用的分子机制模型。PC作为氧化还原电容器通过缓冲电子流，维持PQ和Fd的低还原状态，减少ROS生成(图7B)。此外，降低的Fd还原水平抑制淀粉合成，促进碳流向生长相关代谢，实现碳分配优化(图7B)。
PC通过调节ETC氧化还原状态增强光合效率：PC过表达增加了PC池的氧化能力(PC⁺比例升高)，加速了PQH2在Cytb6f复合体的氧化，从而维持PQ池的低还原状态。这缓解了PSII供体侧的电子堆积，减少了ROS生成(如超氧阴离子)，并促进LEF和ATP合成。此外，Fd还原水平的降低可能通过抑制Fd-TRX系统，减少淀粉合成，使更多碳流向CBB循环，增强CO2固定(图5B)。
PC在高光适应中的双重作用：短期高光胁迫下，PC通过增强ΔpH(跨膜质子梯度)提高qE型NPQ，快速耗散多余光能(图2E)。长期高光暴露则诱导PC积累，通过转录调控(如LHCB基因上调)优化光能捕获，并维持PSII修复能力(图6I)。这种动态调控使藻细胞在高光下实现生长与光保护的平衡。
PC与碳代谢的偶联：淀粉含量减少是OEPC的显著特征(图4)。作者提出，低Fd还原水平抑制了AGPase活性，而CBB循环的增强进一步将碳通量导向生物量合成而非储存。这种代谢重编程可能在自然环境中帮助藻类适应光强波动，避免碳储存过量对生长的反馈抑制。
PC调控的分子网络：转录组分析显示，PC过表达导致光合天线蛋白、CBB循环及叶绿素代谢相关基因显著上调。例如，LHCB家族基因的表达增加可能增强了光捕获能力，而RBCS和GAP3的上调直接促进碳固定。这些变化共同构成了PC介导的光合优化网络。
电话：021-32555118