Ampha Z32阻抗流式细胞仪（IFC）可在单细胞水平上快速表征大量细胞活性状态。测试全过程无需使用任何标记物和染料，基于悬浮液中单细胞本身的电阻抗特性，实现对细胞活性的在线、高通量、快速、无损检测。本实验使用Ampha Z32阻抗流式细胞仪（IFC）测试了不同培养状态下BL2细胞（起源于Burkitt淋巴瘤）的活性和浓度，并观察了细胞凋亡过程的阻抗相位响应。
Ampha Z32阻抗流式细胞仪（IFC）核心部件是微流控芯片，当悬浮的细胞被泵入微芯片后，在外加交流电场作用下，不同活性状态的细胞会产生不同的阻抗信号。细胞大小、细胞膜活性（离子泵）、细胞内部特性（如液泡或脂质外壳）都会影响细胞所产生的阻抗信号。在变化的电场频率下，仪器即可捕捉到细胞的这些特性，本仪器可以在0.3-30MHz范围内的电场频率下同时检测4个不同频率下细胞的电阻抗特性，如低频（0.1-0.5MHz）和中频（0.5-5MHz）分别捕捉有关细胞体积和细胞膜性能的信息，而更高频率（>5MHz）中则更倾向于探测细胞内结构和细胞质特性。
图1 A）Ampha Z32阻抗流式细胞仪；B）微流控芯片
阻抗原始信号由实部（电阻）和虚部（容性电抗）组成（图2B），经信号分析后在AmphaSoft软件中以相位-振幅散点图的形式输出（图3）。散点图上每个数据点对应一个测细胞的阻抗响应。根据样品细胞浓度的不同，每秒可以分析数百到上千个细胞。
图2 BL2细胞的阻抗信号
A) 每秒的原始信号。每个振幅对应于细胞通过微流控芯片电场时的信号。B) 部分原始信号的放大，显示了两个活细胞和一个死细胞的阻抗响应。原始信号由实部（蓝线）和虚部（绿线）组成。通过识别实部和虚部信号的峰值，换算成每个细胞的相位角和振幅。
AmphaSoft软件可直观的输出每个测试样品的相位-振幅散点图，并进行活性-失活类群分析、不同样品的叠加分析以及选定类群的统计分析，并可以.CSV，.HTML及.PNG格式输出综合报告和结果。此外，针对不同样品的测试模板方便用于同系列和同类型样品的重复测量和比较。
图3 BL2的相位-振幅散点图
如图3所示，在10 MHz测量频率下，该培养状态的BL2细胞的活性为83.37%。相位-振幅散点图的顶部和右侧分别显示了相位直方图和振幅直方图。当使用多个频率测量细胞时，AmphaSoft软件可在同一个界面输出每个频率的测量结果，直观对比细胞对不同频率的阻抗响应。上图散点图中的左侧类群对应于死细胞，而右侧类群对应于活细胞。颜色差异显示了细胞的密集程度。
Ampha Z32的测试流程
Ampha Z32测量过程无需对细胞进行染色标记，且样品的使用量很小。测量前只需经过稀释、添加测量缓冲液和过滤三个步骤。
（一）从细胞培养液中取样，通常仅需50–100μl；
（二）根据细胞类型和应用，选取合适的测量缓冲液稀释样品；
对于BL2细胞而言，使用AF6测量缓冲液。通常，如果直接从培养液中提取样品，则建议在1:1到1:10之间稀释。
（三）过滤以去除颗粒团块；此步骤取决于细胞培养物的大小、纯度以及颗粒与芯片通道横截面的比率。
对于BL2细胞，不需要过滤步骤。
（四）上样测量；测试过程全自动，并在达到某个设定停止条件（时间、细胞数量、体积）或用户手动停止测量时结束。
不同培养时期BL2细胞的活力
活的和失活的BL2细胞的阻抗信号有明显的差异（图2B）。在相位-振幅点图中，两者归属于不同的散点云类群。失活细胞在低阻抗相位角形成一个封闭的云群，而活细胞通常在高阻抗相位角形成一个分布更广泛的云群。对处于不同培养时期的细胞，随着细胞开始凋亡和死亡，活细胞云群的相位角逐渐减小。
图4 不同培养时期BL2细胞的活力分析
图5 不同培养时期BL2细胞的阻抗相位和细胞活力的变化
图5显示BL2细胞在培养的0、1、2和6天内阻抗相位和细胞活力的变化。从图中可以看到，在第1天之后，BL2活细胞群发生明显相移且细胞活力的急剧下降。
BL2细胞浓度
除了细胞活力之外，Ampha Z32阻抗流式细胞仪还可准确测量BL2的总细胞数、活细胞和死细胞浓度。为了确定浓度的线性测量范围，本实验制备了一系列稀释液。
● 以1,500rpm的转速将细胞离心2分钟来收集BL2细胞样品，然后弃去上清液并用新鲜的测量缓冲液重新悬浮细胞。
● 之后按1:3、1:9和 1:27稀释浓度制备稀释液，并重复测量三次。
● 使用Neubauer计数板对1:3稀释液进行定量。
一系列稀释液的测量结果显示如图6A所示，两种检测方法的计数结果显示出高度的线性一致性。然而高浓度细胞（> 2×106个cells/ml）会导致Ampha Z32的阻抗信号重叠，这是由于高浓度下，多个细胞容易紧密通过或重合通过微流控芯片（图5C），这将导致细胞浓度被低估。此时可使用测量缓冲液调整稀释倍数，使样品浓度达到合适的测定范围。图5B中的结果表明Ampha Z32活力测定结果的可重复性极高，且不受细胞浓度影响。
图6 Ampha Z32测试的合理浓度范围
A) IFC法与Neubauer计数板的相关性分析（n=3，sd=±3%）；B) 不同稀释倍数下的细胞活力，细胞活力不受细胞浓度的影响（非配对t检验，p>0.05）;C) 原始样品和按1:27稀释后，细胞阻抗信号示例（2MHz频率下）。高浓度原始样本出现干扰信号（最左边的信号）和双峰信号（虚线框），这是由于细胞紧密通过或重合通过微流控芯片。相比之下，1:27稀释后的样品具有更明显和离散的粒子信号。
BL2细胞的凋亡过程
Staurosporine是一种蛋白激酶抑制剂和细胞凋亡诱导剂。图7显示在Staurosporine诱导下，BL2活细胞群的阻抗信号变化（相移），直到细胞全部死亡。
从该诱导过程（图7）以及培养过程（图4A）中细胞阻抗信号的变化可以发现，在整个细胞凋亡过程中，细胞从高相位角（≈325°，活细胞和增殖细胞）经中间过渡状态（细胞凋亡）到低相位角（≈235°，死细胞）。因此，相位角可以作为指示细胞状态的一个有效指标。
图7 Staurosporine诱导下BL2细胞的凋亡过程
A）Staurosporine诱导后，BL2细胞相位直方图随时间的变化。活细胞群在诱导初期(t<10min)快速发生相移，之后稳步发生变化，直到细胞开始死亡(t>1.5h)。该相位直方图10MHz电场频率下获得。B）Staurosporine诱导的50个小时内，BL2细胞活力的变化过程。从图中可以看出，接触Staurosporine诱导1.5h后，BL2细胞的活力迅速下降，此时对照组（DMSO诱导）BL2细胞仍处于生长状态。18h后，对照组BL2细胞活力才开始降低。
结论
本次实验结果表明，Ampha Z32阻抗流式细胞仪是一种在单细胞水平上测量细胞电特性的强大的无标记检测方法，并可以>1,000个Cells/s的采集速率实现细胞的高通量检测。每个细胞的测量阻抗数据实时显示在相位-振幅散点图中，测量结束后可以快速识别和量化活细胞和死细胞，并获得各自的细胞浓度。此外，根据阻抗相位的变化还可准确预判细胞状态，即细胞的存活、凋亡或死亡。
因此，我们认为Ampha Z32阻抗流式细胞仪（IFC）是一种可以无标记、快速表征细胞状态的检测技术，在监测细胞培养物的浓度和活力、对凋亡诱导剂、细胞毒剂或其他试剂的剂量反应或反映进程中有着广阔的应用前景。
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