细胞活力的测定在生命科学和生物技术的许多领域都是必不可少的环节。传统上，细胞活力通常通过宽视野光学显微照片中染色细胞的半自动或自动计数来确定，通常这种检测方法需要额外的染色标记过程，故很难作为在线或原位快速检测的手段。Ampha Z32微流控阻抗流式细胞仪（IFC）是一种基于Coulter原理的无需标记的单细胞检测技术，可在线快速、准确测定悬浮液中单细胞的活性状态。Ampha Z32不含光学元件，无需调整和校准，便于携带，不仅可在实验室使用，还同样适用于实验室外的检测。此前，Ampha Z32多用于花粉质量分析，但目前其也逐步应用到细胞生物学的许多领域，如检测癌细胞的活力、分化和凋亡（Ampha Z32阻抗流式细胞仪在癌细胞状态鉴定中的应用）；监测牛红细胞寄生虫感染过程；成纤维细胞分化为脂肪细胞的研究；甚至是纳米材料毒性评估（Ampha Z32阻抗流式细胞仪在纳米材料毒性筛选中的应用）等方面。本文利用Ampha Z32精确并快速的评估了正常和热灭活、发酵过程中以及长期好氧间歇培养过程中酵母细胞的细胞活力和细胞状态，并与常规染色方法进行了比较。此外，还监测了感染杆状病毒后昆虫细胞活性的变化并预测了胞内蛋白的理想收获时间。
图1 IFC法与PI荧光染色法测定的酵母活性的相关性A）10MHz频率下酿酒酵母（Scc ATCC 9080）活细胞（未处理；绿点）和死细胞（热处理；红点）的IFC相位角（x轴）-振幅（y轴）叠加散点图；B）IFC法（n=3，std=0.15%）和染色法（n=3，std=4.4%）的相关性分析（R2=0.996）IFC法：本实验中未经处理和热处理的酵母死细胞样品按预定比例（1:0、3:1、1:1、1:3、0:1）混合至100μl，之后用AF6缓冲液进一步稀释至2ml，经20μm过滤器过滤后上机测试，三次重复，细胞采集数目设定为20000。PI法：200μl AF6和100μl 3.0μg/ml碘化丙啶（PI）稀释100μl上述未经处理/热处理的细胞混合物，并使用荧光显微镜（Leica）计数PI染色（死亡）和未染色（存活）细胞。实验结果表明，相较于传统染色镜检法，Ampha Z32阻抗流式细胞仪（IFC）操作简单、测量快速，是一种统计性、重复性、测量精度以及标准化程度都更高的检测方法。常规培养下和两性霉素B（Sigma）处理后酿酒酵母活性的变化
图2 常规培养下酿酒酵母（Scc ATCC9080）活性的变化（IFC法）
图3. 常规培养下和两性霉素B（Sigma）处理后酿酒酵母活性的变化A）常规培养下，酿酒酵母（Scc ATCC 9080）活性相位直方图随时间的变化（10 MHz）。C）在添加1µg/ml的两性霉素B后的0-5h内，酿酒酵母（Scc ATCC 9080）活性相位直方图的变化酿酒酵母（Scc ATCC 9080）常规培养，即250 ml锥形瓶中在28°C的摇动培养箱中培养数天，培养基为100 ml YPD。两性霉素B（Sigma）处理，即将常规培养中处于指数生长时期的酿酒酵母细胞暴露于1µg/ml的两性霉素B中。图2为接种培养后的第1、7和14天，酿酒酵母的相位-振幅散点图的变化，从图中可以看出，在接种培养的第7天出现两个明显可区分的类群。在培养的18天中，可以清晰看到活性酵母类群的逐渐向低相位和较小振幅移动（图3A），也就是说，随着培养时间的延长，酵母细胞活性逐渐下降（图3B）。此过程反映了在长期好氧间歇培养中，因营养限制而导致的酵母细胞的死亡过程。图3C同样观察到经两性霉素B（Sigma）处理后，酿酒酵母细胞的活性逐渐降低，但这一过程反映的是毒性化合物诱导下酵母细胞的死亡过程。这表明IFC还可应用于悬浮细胞的无标记毒理学研究，例如用于IC50值的测定。
A） 开始发酵后的前3天，酵母细胞的相位-振幅散点图变化。B） 发酵过程中的酵母细胞的密度（黑色）、活力（橙色）和乙醇浓度（蓝色）随时间的变化。啤酒酿造发酵罐中的生长条件与前面讨论的情况不同，图4记录了酵母的发酵过程，开始的第1天（红色）到第2天（绿色），酵母细胞呈指数增殖，细胞浓度从5.4增加到25.3 x 106细胞/ml，细胞活力从57.1增加到83.9%（图4B）。第3天结束时，酵母细胞（蓝色）移向较低的相角，这意味着细胞浓度的增长减慢，细胞活力下降。而发酵罐中乙醇浓度从第一天的0.1%迅速增加到第三天的3.1%（图4B）。这是由于培养第一天细胞浓度低、活力低且发酵罐中仍存在大量氧气，当发酵罐中的氧气全部消耗完后，酵母转入厌氧乙醇发酵，乙醇浓度迅速增加，而乙醇浓度增加又会对酵母细胞产生毒性，故酵母细胞活性降低。IFC的检测到的活性相位变化与以上响应过程高度一致。本文利用Ampha Z32（IFC）分别跟踪了感染和未感染染杆状病毒（BV）的Sf9昆虫细胞培养物在首次传代后的99h内的活力变化。
图5 感染杆状病毒（BV）后的Sf9昆虫细胞活性的变化
图S4 感染杆状病毒（BV）后的Sf9昆虫细胞活性相位叠加图上图为Sf9昆虫细胞在感染杆状病毒后的数小时（hpi）内，相位-振幅散点图的变化（0hpi为感染前的参考培养物）。在BV感染从0到99 hpi的整个过程中，相位-振幅散点图的可明显分离出三个细胞类群，分为是活细胞（viable）、感染晚期（LPI）和死细胞（dead）类群（图5）。类似于酵母（图1），在较高的相位值（150˚到220˚）下分离出“活”细胞类群。这部分活细胞在感染后的0-48hpi，阻抗振幅增加了约60%，这与感染后细胞的“膨胀”状态相一致。阻抗振幅的变化提供了感染水平的定量读数，可用于从病毒滴定分析中确定病毒与细胞比率（感染多重性，MOI）。48hpi后，活细胞的阻抗振幅降低（细胞萎缩）且数量逐渐减少，直至99hpi细胞全部死亡（见图6）。感染晚期（LPI）细胞类群出现在较低相位，这部分细胞在0-60hpi逐渐增加随后减少直至消失，这是由于感染后期的细胞裂解所致。
图S3 未感染杆状病毒（BV）的Sf9昆虫细胞活性的变化上图为未感染杆状病毒（BV）的Sf9昆虫细胞活性的变化，同感染细胞一致，相位-振幅散点图也可分离出活细胞（viable）、感染晚期（LPI）和死细胞（dead）类群。如图所示，细胞活力(97.9 %±0.7 %)在79 hpi的连续生长过程中始终保持不变。仅当在99 hpi超过典型的继代间隔时间时，细胞活力下降至约93.1%，这可能是由于营养限制或细胞密度过高所致。与感染的Sf9昆虫细胞的相位-振幅散点图（图5）相比，未感染细胞的振幅分布（与细胞大小相关）在0-60h内略有变窄，而直到60h才明显检测到LPI（感染晚期）细胞类群，到99h时该类群略有增加。感染杆状病毒（BV）后的Sf9昆虫细胞活力和重组蛋白表达的时间动力学变化本文除利用IFC法、台盼蓝染色镜检法追踪了感染杆状病毒（BV）后的Sf9昆虫细胞活性的动力学变化，还同时利用绿色荧光蛋转染Sf9细胞以量化重组蛋白的产量，下图为感染杆状病毒（BV）后的Sf9昆虫细胞活力和重组蛋白表达的时间动力学变化。
图6 感染杆状病毒（BV）后的Sf9昆虫细胞活力和重组蛋白表达的时间动力学变化结果表明，在感染BV后的24hpi内，IFC法与台盼蓝成像细胞计数器的检测结果高度一致；24-60hpi内，IFC法检测到的活性快速下降到50%（红实线），而台盼蓝成像细胞计数器检测到的细胞活性下降缓慢，仅从100%下降到80%（蓝实线）；从60hpi后，细胞活性均快速下降，但到99hpi时，IFC法的检测结果仅为5%，而台盼蓝成像细胞计数器的检测结果为42%；整个测试过程中，两者差异在79hpi时达到最大，分别为11%和78%。79hpi的相位-振幅散点图（图5）表明此时IFC法可以准确捕捉到细胞阻抗信号发生了巨大变化（细胞的大规模重组），而台盼蓝成像细胞计数器却不能及时检测到这一变化。在BV感染的不同阶段，细胞大小有显著差异。因此，台盼蓝成像细胞计数法通常用细胞大小表征BV感染的状态和重组蛋白的产量质量。如图7所示，在23-60 hpi之间，感染细胞从最初的12.8μm膨胀到约16μm，然后在99 hpi时最终缩减到8.5μm（图7A，红色虚线）。这与IFC法获得的平均振幅（图7A，黑色虚线）的变化趋势非常相似，分析表明，振幅数据与平均细胞大小有很好的相关性（R2=0.901）（图7B）。也就是说IFC法不仅可以评估细胞的活力，还可以评估细胞的大小。
图7 感染杆状病毒（BV）后的Sf9昆虫细胞大小的变化相较于台盼蓝成像细胞计数法，IFC法可进一步将失活细胞区分为感染晚期（LPI）和死细胞（dead）两个类群（图5）。随感染时间的延长，LPI类群的细胞在48-60 hpi内逐渐增多，到72 hpi几乎全部消失。这一类群的大小与裂解细胞中检测到的表达trGFPuv的浓度相关（图6，红色虚线和黑色实线）。随着BV感染的进一步发展，表达的trGFPuv随细胞裂解释放到培养基中（图6，黑色虚线），其浓度的变化与IFC确定的死亡细胞总数的比例完全一致（图6，红色虚线）。尽管细胞外表达的trGFPuv的数量最终会超过细胞内的trGFPuv，但培养基中的不必要反应和裂解细胞释放的蛋白酶可能会降低表达蛋白的质量，因此研究者并不希望将这部分释放的蛋白质用于后续应用。由于IFC法检测到的LPI群体与表达的胞内蛋白密切相关，因此利用Ampha Z32（IFC）可以很好地预测胞内蛋白的理想收获时间。以上研究表明，Ampha Z32（IFC）微流控阻抗流式细胞仪是一种快速、可靠、无标记的细胞活力检测技术。不仅可以在发酵过程中可靠测定细胞活力，细胞大小的变化，评估培养条件；还可以在昆虫细胞bv感染过程中筛选理想的表达条件、病毒滴度，预测BV昆虫细胞系统中获得胞内蛋白的理想时间，可广泛应用于微生物和动物单细胞的培养中。
